Thèse Évaluation du Pouvoir Transformant de l'Exposition Chronique à un Cocktail de Pesticides en Supplémentation ou Non a un Prébiotique sur les Cellules Épithéliales Coliques Rôle de l'Axe Micro H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université de Picardie - Jules Verne École doctorale : Sciences, Technologie, Santé Laboratoire de recherche : PéRITOX - Laboratoire Périnatalité et risques Toxiques Direction de la thèse : Hafida KHORSI CAUET Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-05-30T23:59:59 L'exposition chronique périnatale aux résidus alimentaires de pesticides constitue un enjeu majeur de santé publique en particulier dans la Région des HD. Des données épidémiologiques suggèrent un lien entre pesticides et cancer colorectal (CCR) ainsi que des maladies neurodéveloppementales, mais les mécanismes cellulaires et moléculaires restent peu élucidés.
Ce projet vise à étudier l'impact d'un cocktail de pesticides fréquemment retrouvés dans l'alimentation (chlorpyrifos, glyphosate, imazalil) sur des cellules coliques normales et cancéreuses, ainsi que sur le rôle du microbiote dans l'axe intestin cerveau à l'aide de différents modèles in vitro (intestin artificiel, (SHIME®/BabySHIME), les barrières intestinales (BI) et Hématoencéphalique (BHE)).
Les objectifs sont : (i) évaluer les effets du cocktail sur la prolifération, migration, apoptose et invasion cellulaire ; (ii) identifier les voies de signalisation impliquées (NF-B, Wnt/-caténine, PI3K/AKT/mTOR, ERK1/2) ; (iii) analyser les modifications épigénétiques induites ; (iv) caractériser l'impact du microbiote (à partir de fèces de femmes enceinte et des bébés) exposé aux pesticides via les modèle SHIME®, BI et BHE; (v) proposer une stratégie préventive basée sur des prébiotiques afin de contre carrer l'effet des pesticides.
Les pesticides comprennent les insecticides, herbicides, fongicides ou fumigants. Ils sont, en outre, sous-classés, en fonction de leur mécanisme d'action, comme les organochlorés, les organophosphorés, les carbamides, les pyréthrinoïdes et autres. L'utilisation massive de pesticides constitue un grave problème de santé publique dans le monde, causant environ 300 000 décès chaque année. La France et en particulier la région Hauts-de-France est une région fortement agricole et consommatrice de pesticides (INSERM, 2013). On estime que dans les années à venir, la quantité de pesticides rejetés dans l'environnement sera encore plus importante, en raison de la nécessité de fournir de la nourriture à une population mondiale croissante, ainsi que de faire face à diverses maladies infectieuses. Par conséquent, toutes les populations humaines seront inévitablement exposées à cette classe de produits chimiques, directement ou indirectement. Malgré les dispositions mises en place pour limiter l'utilisation de pesticides seuls ou en cocktails, l'exposition de ces xénobiotiques reste importante. Ces mélanges de résidus de pesticides peuvent donner lieu à des impacts sanitaires difficilement prévisibles actuellement, ce qui fait de la question de l'exposition chronique des cocktails à des faibles doses un enjeu de santé publique. Chaque individu est exposé au cours de sa vie à une multitude de pesticides, majoritairement par l'intermédiaire de l'alimentation. Le tube digestif est le premier organe à entrer en contact avec les résidus de pesticides. Les pesticides sont clairement identifiés comme des perturbateurs de l'homéostasie tissulaire, avec un risque évident sur la santé humaine à long terme. En effet, plusieurs études, à partir de modèles animaux et de cohortes observationnelles, ont établi un lien entre l'exposition aux pesticides et le développement de nombreuses pathologies notamment le cancer (Baudry et al., 2018; Calaf, 2021). La dernière expertise collective de l'INSERM de 2021 conclut qu'il existe une présomption forte d'un lien entre l'exposition aux pesticides dans un cadre professionnel et le cancer de la prostate, les lymphomes non hodgkiniens et le myélome multiple (Inserm, 2021). Il existe également une présomption forte d'une augmentation du risque de leucémies et de tumeurs du système nerveux central chez l'enfant lors d'une exposition au cours de l'enfance ou durant la grossesse. Cependant, très peu de données expérimentales sont disponibles sur d'autres cancers tels que le cancer colorectal (CCR). Avec près de 45 000 nouveaux cas et 18 000 décès par an, le CCR se place au troisième rang des cancers les plus fréquents et reste le second le plus meurtrier en France. Des études ont démontré que les patients atteints de CCR présentent des taux sanguins de résidus de pesticides plus élevés que la population générale, notamment concernant la famille des organochlorés et organophosphorés (Abolhassani et al., 2019; Lee et al., 2018; Park et al., 2021). De plus, une récente revue a permis de mettre en évidence une liste spécifique de pesticides entrainant un risque plus important de développer un CCR (Matich et al., 2021). La cohorte AGRICAN a démontré que les agriculteurs français cultivant des légumes et des fruits et donc fortement exposés aux pesticides présentent un risque augmenté de développer un CCR (Talibov et al., 2022). In vitro, l'exposition des cellules d'adénocarcinome du colon au chlorpyrifos et au dichlorodiphényltrichloroéthane, augmente, respectivement, la prolifération cellulaire via la voie de signalisation EGFR/ERK1/2 (Suriyo et al., 2015) et le stress oxydant (Song et al., 2014). Finalement, une étude récente a montré que l'exposition de lignées cellulaires de CCR à un cocktail de 5 pesticides parmi les plus retrouvés dans les résidus alimentaires des français en 2006 entraine des lésions de l'ADN et des modifications du cytosquelette (Mechanisms et al., 2021). Tous ces éléments suggèrent fortement l'impact des pesticides sur le processus de la cancérogénèse du colon.
Au niveau cellulaire, le traitement chronique par des pesticides s'accompagne d'une réaction inflammatoire, (augmentation de la production de cytokines inflammatoires : TNF-, interleukine-6 (IL-6) et interleukine-1 (IL-1) (Jung et al., 2015; Sule et al., 2022) la production de ROS (dérivés réactifs de l'oxygène tels que radicaux libres) (Uchendu et al., 2018) et l'augmentation de l'activité des caspase-3 et 9 (Ojha & Gupta et al., 2015).
Un autre élément-clé de la régulation des contaminants alimentaires est le microbiote intestinal (MI), c'est-à-dire les bactéries qui colonisent le tube digestif et qui dialoguent, entre autres, avec le cerveau (Parker et al., 2020). Cet écosystème microbien intestinal est devenu aussi un sujet brulant en recherche en raison de sa contribution à de nombreuses pathologies tels que les maladies inflammatoires ou le cancer (Bander et al., 2020; Y. Wang & Li, 2022). Dans des conditions normales et saines, le mucus est une barrière étanche de cellules épithéliales qui confinent la plupart des microbes à la lumière intestinale (Ghasemi-Niri et al., 2016; Qiu et al., 2020). L'augmentation du stress oxydatif et des marqueurs inflammatoires, engendrée par l'action des pesticides sur le MI serait à l'origine d'une inflammation chronique, d'une altération du phénotype cellulaire (Matich et al., 2021) et d'une résistance à la chimiothérapie (Doganlar et al., 2020).Ainsi, nous émettons l'hypothèse que l'exposition chronique à des concentrations subliminaires d'un cocktail de pesticides (chlorpyrifos, glyphosate et l'imazalil) les plus retrouvés dans notre alimentation pourrait induire une dysbiose intestinale, une perméabilité intestinale, une translocation bactérienne et de modifications épigénétiques favorisant l'apparition de lésions intraépithéliales inflammatoires et donc le risque de CCR. Nous déterminerons aussi la manière dont les acides gras à chaines courtes, pourraient atténuer significativement les dysfonctionnements constatés tant au niveau du MI que sur le phénotype épithélial.
Les objectifs sont : (i) évaluer les effets du cocktail sur la prolifération, migration, apoptose et invasion cellulaire ; (ii) identifier les voies de signalisation impliquées (NF-B, Wnt/-caténine, PI3K/AKT/mTOR, ERK1/2) ; (iii) analyser les modifications épigénétiques induites ; (iv) caractériser l'impact du microbiote (à partir de fèces de femmes enceinte et des bébés) exposé aux pesticides via les modèle SHIME®, BI et BHE; (v) proposer une stratégie préventive basée sur des prébiotiques afin de contre carrer l'effet des pesticides. Le programme de travail :

Ce projet exige des approches multidisciplinaires nécessitant des échantillons humains, des lignées cellulaires normales, ainsi qu'une grande variété de techniques expérimentales. Toutes ces techniques sont utilisées en routine dans les laboratoires des différents partenaires des projets PESTIPRÉDIS (ANSES/ECOPHYTO, 2025-2028) et projet PESTICCR (Ligue contre le cancer, 2024-2027). L'accord du CERNI est obtenu.

- Choix pesticides : Les pesticides envisagés, sont le chlorpyrifos ; insecticide, l'imazalil (fongicide), et le glyphosate (herbicide). Le rapport de 2019 de l'Union Européenne montre que ces résidus de pesticides sont présents dans les produits alimentaires de notre quotidien (Carrasco Cabrera & Medina Pastor, 2021; Nougadère et al., 2014). Le chlorpyrifos interfère avec le système endocrinien et dérégule la composition du microbiote intestinal (Li et al., 2019). Cette dysbiose intestinale change les métabolites produits par les microorganismes et induit ainsi une inflammation intestinale et une augmentation de la perméabilité intestinale (Zhao et al., 2016). L'imazalil est un fongicide qui provoque une dysbiose intestinale et une inflammation colique (Jin et al., 2016). Le glyphosate modifie également la composition microbienne intestinale chez les rats et induit des réponses inflammatoires au niveau de l'intestin (Tang et al., 2020). Une étude en 2018, montre que le glyphosate a un impact sur l'axe intestin-cerveau en favorisant la prolifération des bactéries Clostridium chez des sujets autistes (Argou-Cardozo & Zeidán-Chuliá, 2018). De plus, The International Agency for Research on Cancer a identifié le glyphosate comme carcinogène probable en 2015.
Deux lignées cellulaires intestinales du colon sain seront utilisées dans ce travail : NCM460 et CCD 841 CoTr. Les cellules seront exposées pendant 3 et 30 jours au cocktail de pesticides ou au MI-coktail.
La prolifération, survie, migration et invasion seront évaluées par les tests de MTT, test de blessure et de chambres de boyden sans/avec matrigel, cytométrie en flux. Le sécrétome (en particulier le TNF, IL-6, et des espèces réactives de l'oxygène (par Kit, qPCR). L'apoptose sera évaluée par différentes techniques : (double marquage Annexine V/7-AAD, ratio Bcl2/Bax, Hoescht et effet «Tunel», clivage des protéines PARP et Caspases 3 et 9). L'analyse épigénétique sur des cellules normales et cancéreuse traitées par le cocktail des pesticides sera réalisée par différentes techniques : Bisulfite sequencing pour détecter la méthylation de l'ADN et Chip-seq (chromatine immunoprécipitations sequencing) pour identifier les modifications d'histones.
L'ensemble de ces expériences seront réalisées au sein du laboratoire PériTox en collaboration avec le laboratoire LPCM et avec une nouvelle collaboration internationale représentée par le laboratoire TMPAC (Liban).

- Le modèle SHIME® (ou simulated human intestinal microbial environment) : modèle d'intestin artificiel : sera utilisé pour l'étude in vitro sur la perturbation du microbiote intestinal. Celui-ci mime chaque compartiment du tractus digestif de l'adulte (de l'estomac au côlon) et permet de mesurer l'activité et la transformation de l'aliment.
Des selles de 20 volontaires sains seront ensemencées dans les fermenteurs coliques (colon ascendant, transverse et descendant) du SHIME. Les pesticides en combinaison (à la dose journalière admissible, 1mg/1mL) seront inclus dans l'alimentation du SHIME® 1 fois par jour pendant 30 jours (Joly Condette et al., 2015 ; Reygner et al., 2016). Après exposition chronique à ce cocktail, les échantillons seront collectés et analysés à J0 (contrôle), J15 et J30 (effet chronique à court et long terme). La composition du microbiote (culture bactérienne, qPCR, NGS) et les métabolites bactériens (GC) seront analysés dans les différents compartiments du SHIME®. Le niveau des marqueurs inflammatoires dans les surnageants issus de la digestion in vitro (SHIME®) (protéine C-réactive ; cytokines pro-inflammatoires telles que TNF, IL1, IL6, IL10, TGF) sera analysé par des tests ELISA.
L'expression et la localisation des protéines des jonctions serrées (occludine, claudine-5, ZO-1) dans le modèle de barrière intestinale fera l'objet d'une caractérisation par qRT-PCR et Western blot, et immunocytochimie. La translocation bactérienne à travers la barrière intestinale sera évaluée par culture bactérienne et typage moléculaire. L'expression des molécules d'adhésion telles que ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1 sur la surface cellulaire des cellules épithéliales ainsi que les voies de signalisations (MAPK, NFkB) seront détectées par RT- qPCR et western blot.
L'ensemble de ces expériences seront réalisées au sein du laboratoire PériTox en collaboration avec les laboratoires LBHE, LPCM et avec une nouvelle collaboration internationale représentée par le laboratoire TMPAC (Liban).

- Prélèvement biologique :
Le service d'hépatogastroenterologie du CHU d'Amiens (Pr Fumery Mathurin) participe au dépistage, au diagnostic et au traitement du CCR. C'est le principal centre de recours de Picardie sur cette thématique. Le service d'hépatogastroenterologie dispose d'une collection biologique au sein de la Biobanque de Picardie contenant du sérum, plasma et une fécalothèque dans le cadre de collections s'intéressant à des patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, de pancréatite, ou d'hépatite alcoolique aigue ou encore de témoins. Un biobanking systématique de prélèvements sanguins et fécaux de patients avec un diagnostic récent de CCR est en cours de mise en place avec le partenariat de la Biobanque de Picardie.

Le projet sera divisé en 5 tâches pour une durée totale de 3 ans.

Objectif 1 : Évaluer l'effet de l'exposition chronique à un cocktail de pesticides sur la biologie des cellules intestinales normales : morphologie, prolifération, apoptose/autophagie, mortalité, migration, invasion.

Les cellules des deux lignées cellulaires intestinales saines (CCD841-CoN) et cancéreuses (HTC116) du colon seront exposées à un mélange de 3 pesticides (concentration totale du mélange 6 µM dans le DMSO) pendant 3 jours (traitement aigue) et 30 jours (traitement chronique). Le mélange sera changé chaque 72h. Les cellules contrôles seront incubées dans le même milieu de culture avec DMSO (500 ml) afin que des échantillons jusqu'à 50 ml puissent être collectés sans impacter l'activité et la composition du microbiote résident. Chaque fermenteur mime une partie du tractus digestif : estomac, jéjunum/duodénum, ilion/caecum, colon ascendant, colon transverse et colon descendant (voir Fig. 4). Ceux-ci sont maintenus à 37°C par un bain marie et agités en permanence pour imiter les mouvements qui ont lieu dans l'intestin. Les fermenteurs sont reliés entre eux par des pompes péristaltiques qui permettent de recréer un temps de rétention des produits de l'intestin dans chacun des compartiments. Le dispositif est contrôlé par informatique, le pH et le potentiel redox sont constamment mesurés afin de s'assurer que les conditions physiologiques de chaque fermenteur soient similaires à celles que l'on trouve in vivo. Le potentiel redox est un indicateur de l'activité de l'oxygène, lorsqu'il est inférieur à -200 mV, le fermenteur est en condition anaérobie. Si ce n'est pas le cas, l'ajout de gaz est nécessaire.
Une combinaison de ce modèle avec un modèle in vitro de la barrière intestinale permettrait de compléter l'investigation sur la sphère digestive par l'impact sur la perméabilité et la fonctionnalité de l'épithélium (en collaboration avec PERITOX et LBHE).

Nous avons déjà le MI et le MI-CPF et MI-Cocktail obtenus sur 20 volontaires. Dans le cadre de ce projet de thèse, des selles de 20 patients atteints de CCR seront ensemencées dans les fermenteurs coliques (colon ascendant, transverse et descendant) du SHIME®. Le CPF et le cokctail (à la dose journalière admissible) seront inclus dans l'alimentation du SHIME® 1 fois par jour pendant 30 jours. Après exposition chronique à ce cocktail, les échantillons seront collectés et analysés à J0 (contrôle), J15 et J30 (effet chronique à court et long terme). La composition du microbiote (culture bactérienne, qPCR, NGS) et les métabolites bactériens (GC) seront analysés dans les différents compartiments du SHIME®. Les pesticides seront dosés (prestation- Laboratoire IMITOX, Chambly (LC-MS/MS)). Le niveau des marqueurs inflammatoires dans les surnageants issus de la digestion in vitro (SHIME®) (protéine C-réactive ; cytokines pro-inflammatoires telles que TNFa, IL1, IL6, IL10, TGFb) sera analysé par des tests ELISA. L'expression et la localisation des protéines des jonctions serrées (occludine, claudine-5, ZO-1) dans le modèle de barrière intestinale (cellules CaCo2) fera l'objet d'une caractérisation par qRT-PCR et Western blot, et immunocytochimie. La translocation bactérienne à travers ce modèle de barrière intestinale sera évaluée par culture bactérienne, typage moléculaire et dosage de métabolites bactériens comme le LPS par Limulus Assay et les muropeptides par LC/HRMS. L'expression des molécules d'adhésion telles que ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1 sur la surface cellulaire des cellules épithéliales ainsi que les voies de signalisations (MAPK, NFkB) seront détectées par RT-qPCR et Western blot. L'expression de PPAR et PPAR, qui sont liés à l'état inflammatoire et à la réponse immunitaire mais aussi au métabolisme, sera également quantifiée.
En parallèle, nous récupérons les surnageants des 3 parties du côlon que nous filtrons dans des conditions stériles, puis les cellules normales et cancéreuses seront exposées aux métabolites contrôles du MI-sain (MI) et CCR (MI-CCR) puis au MI exposés au CPF MI-CPF, Cocktail MI-***** (MI volontaires sains) et MI-CCR-CPF et MI-CCR-***** (MI Patients CCR). Nous évaluerons leur impact, en traitement chronique (30j) ou aigue (3j), sur la viabilité, la migration des cellules normales et cancéreuses et la réponse des cellules cancéreuses au 5-FU. Les voies de signalisation ainsi que des modifications épigénétiques seront aussi déterminées (en collaboration avec PERITOX, LPCM et avec une nouvelle collaboration du laboratoire TMPAC, Liban).

Objectif 5 : Exploration des propriétés protectrices par stratégie nutritionnelle à base de prébiotique.

Le modèle SHIMES sera réutilisé en intégrant l'inuline dans son alimentation, en co-traitement avec les pesticides. Les pesticides en combinaison en en coexposition avec l'inuline seront inclus dans l'alimentation du SHIME® 1 fois pendant 30 jours. Les échantillons seront collectés et analysés à J0 (contrôle), J15 et J30 (effet chronique). Nous examinerons les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels ces métabolites améliorent l'intégrité de la BI et le phénotype de cellules de colon après exposition aux pesticides. Nous étudierons les caractéristiques phénotypiques, métaboliques et enzymatiques des barrières, notamment les jonctions serrées, les enzymes spécifiques, les transporteurs, les récepteurs, les voie de signalisation. Des études de fonctionnalités (utilisation d'inhibiteurs spécifiques par exemple) nous permettrons de valider les cibles cellulaires identifiés. Les techniques et méthodes nécessaires ont déjà été détaillées dans les objectifs 2, 3 et 4.
Les techniques et méthodes nécessaires ont déjà été détaillées pour le SHIME dans l'obj 4. Notre attention se portera sur l'analyse de la composition du MI et la concentration de ses métabolites. Cela implique le dosage des métabolites microbiens. Nous nous concentrerons sur les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels ces métabolites améliorent l'intégrité de la BI, réduisant ainsi le risque de développement du CCR. Cela inclura l'étude des voies de signalisation et la validation des cibles cellulaires identifiées. Les techniques et méthodes nécessaires ont déjà été détaillées dans les objectifs 2,3 et 4.

Le/la candidat(e) devra posséder des compétences techniques en relation avec les modèles in vitro SHIME/BabySHIME (culture classique et moléculaire en microbiologie, maitrise des conditions d'asepsies, travailler en chambre anaérobie, PSM...). Il (elle) devra aussi avoir une très bonne connaissance des techniques de base en culture cellulaire (maintien et transfection de lignées cellulaires humaines) et être bien familiarisé(e) avec les approches de biologie cellulaire et moléculaire et d'étude des protéines (transfection, extraction d'ARN, qRT-PCR, Western-Blot, Facs, MTT ...). Le/la candidat(e) devra posséder une bonne aisance d'expression à l'oral. Il/elle devra être motivé(e), dynamique, rigoureux/se, désireux/se d'apprendre et de s'intégrer dans une équipe de recherche.

• PCR
• Extraction d'ADN